发布时间：2020年1月3日
全国细菌耐药监测网网点医院微生物实验室质量和能力要求（2020年版）
为了保证全国细菌耐药监测结果的准确性，不断提高监测工作质量，遏制细菌耐药性增长，特对影响细菌耐药性监测结果准确性的因素提出规范性要求，包括检验前、中、后全过程，人员、设备、设施、环境、方法学等各方面。
一、人员
微生物实验室负责人应满足以下要求：①具有医学及其相关专业或生物学本科及以上学历，从事微生物检验工作至少3年，或具有医学及其相关专业专科学历，从事微生物检验工作至少5年；②具有中级或以上专业技术职称；③具备细菌学检验质量控制、生物安全相关知识；④具有培训、沟通、管理等能力。
负责细菌耐药监测数据上报人员应从事细菌检验工作至少1年，能够正确使用全国细菌耐药监测信息系统完成数据上报工作，并应用统计软件对本院细菌耐药性监测数据进行分层分析。
从事细菌检验的新员工或离岗半年及以上员工经评估合格后方可独立操作。
从事细菌检验人员应相对固定（至少固定2人），数量满足工作需要，每年需参加专业学习，包括自行组织学习、线上学习、外出学习等形式。
二、设施与环境
设施和环境应与检测内容相适应。
（一）布局
微生物实验室若为独立单元，应划分为实验区和非实验区。实验区应具有安全运行、清洁、维护所需空间，有足够的空间摆放随时使用的物品；非实验区应有存放私人物品的设施、工作人员用餐和休息的场所。微生物实验室若为临床实验室的一部分而非独立单元，可与其它实验室共享非实验区。
（二）设施
1.温度、湿度、通风 应依据所用分析设备和实验过程的要求，制定环境温、湿度控制要求并记录。应有温、湿度失控时的处理措施并记录。
2.照明 避免阳光直射。灯光能够分区控制，以便根据需要调节光线。
3.水槽 安装足够的水槽供染色、废液处理和洗手等使用。洗手水槽应独立设置，不可与处理标本的水槽混用。水龙头应为非手触式，备洗手液。实验室出口附近最好安装洗手水槽，以供工作人员离开时洗手。
4.工作台 工作台面大小、高度适宜，材料应光滑、致密、耐用，易清洁、消毒，抗污染。放置重型设备的工作台足够牢固，减少震动。
5.其他 应配备个人防护装备，如护目镜、防护服、手套、口罩、帽子，以及必要的消防、防盗等安全设施。实验室应配置不间断电源（UPS）和（或）双路电源以保证关键设备（如需要控制温度和连续监测的分析仪、培养箱、冰箱等）的正常工作。宜配备含酒精速干手消毒剂。
（三）生物安全
微生物实验室是对病原菌进行分离、培养、鉴定等临床检测工作的特殊场所，其设计和管理应在风险评估的基础上，确定实验室生物安全水平，确保工作人员在安全的条件下开展工作，遵循安全、舒适、高效的原则，满足以下基本要求：①至少符合生物安全2 级（BSL2）标准；②尽可能减少病原菌对实验室内部以及外部环境的污染；③有足够空间放置仪器设备，工作人员能够安全地从事检验工作和质量控制活动。
国家卫生健康委员会（原卫生部）制定的《人间传染的病原微生物名录》明确规定了各种病原体操作的防护要求，检验过程中发现高致病性病原体时，应按相关法规的要求处理。
由于实验室可能接触高于预期风险的标本，故具有潜在生物危害的标本应在生物安全柜中开盖、处理。信息有限标本的风险评估可参考医学、流行病学资料，如发病率、病死率、可疑传播途径、暴发调查资料、标本来源地信息。
三、设备和试剂
实验室设备的种类和数量应满足临床需要，至少包括：生物安全柜、CO2培养箱、普通培养箱（包括温度可调培养箱）、冰箱、光学显微镜、细胞离心机、组织碾磨器具、游标卡尺（适用时），以及与细菌分离、培养、鉴定、药物敏感性试验相适应的试剂（含培养基、质控菌株等）。
（一）设备校准和计量学溯源
新设备经性能验证，且满足要求方可用于患者标本检测。
应遵循国家、行业要求制定设备和试剂校准、检定周期，并保存记录。鉴定仪、药敏仪、血培养仪的校准应满足制造商的要求，其他建议如下：
1、每12个月进行检定或校准的设备宜包括：生物安全柜（高效过滤器、气流、负压等参数）、CO2培养箱（CO2浓度显示计、温度显示器或温度计）、细胞离心机、压力灭菌器、游标卡尺、普通培养箱（温度显示器或温度计）、温度计、移液器、微量滴定管或自动分配器。
2、每6个月进行检定或校准的设备应包括浊度仪。
3、保存仪器功能监测记录的设备宜包括：温度依赖设施（冰箱、培养箱、水浴箱、加热块等每日记录温度）、CO2培养箱（每日记录CO2浓度和温度）、超净工作台（定期做无菌试验）、压力灭菌器（至少每个灭菌包外贴化学指示胶带、内置化学指示卡，定期进行生物监测）。
（二）设备维护与维修
制定预防性维护计划并记录的设备至少应包括：生物安全柜、CO2培养箱、鉴定仪、血培养仪、压力灭菌器、超净工作台、显微镜和离心机。
如果设备故障影响了方法学性能，如自动化药敏仪器的光学系统故障，在设备修复、校准后，实验室应通过检测质控菌株或已知结果标本的方式进行性能验证。
(三)试剂和耗材验收
试剂和耗材验收试验应符合如下要求：
1、新批号及每一货次试剂和耗材使用前，通过新旧批号平行实验或常规质控等方法进行验证，并记录。
2、新批号及每一货次试剂和耗材，如吲哚试剂，杆菌肽，奥普托辛，X、V、XV 因子纸片等使用阴性和阳性质控菌进行验证。
3、新批号及每一货次的药敏试验纸片使用前以标准菌株进行验证。
4、新批号及每一货次的染色剂（如革兰染色）使用已知阳性和阴性（适用时）的质控菌株进行验证。
5、新批号及每一货次直接抗原检测试剂（无论是否含内质控）使用阴性和阳性外质控进行验证。
6、培养基外观良好（平滑、水分适宜、无污染、适当的颜色和厚度，试管培养基湿度适宜），新批号及每一货次的商品或自配培养基应检测相应的性能，包括无菌试验、生长试验或与旧批号平行试验、生长抑制试验（适用时）、生化反应（适用时）等，应以质控菌株进行验证；
7、一次性定量接种环每批次抽样验证。
(四)自配试剂和耗材记录
自配试剂或培养基，应记录制备过程，内容至少包括：
1、培养基（试剂）名称和类型；
2、配制日期和配制人员；
3、培养基（试剂）的体积；
4、分装体积；
5、成分及其含量、制造商、批号；
6、最初和最终pH值（适用时）；
7、无菌措施，包括实施的方式、时间和温度（适用时）；
四、检验前过程
（一）标本采集手册
实验室应遵循行业标准或指南编写、定期审核标本采集和运送标准化操作程序供医务人员查阅并遵照执行（相关技术资料可参考下文“参考文献”）。
“标本采集手册”除符合通用要求外，还应明确规定以下内容：
1.不同部位标本的采集方法，如：明确说明并执行血培养标本采集的消毒技术、采血量。诊断成人不明原因发热、血流感染时应在24h内不同部位至少采集2套，每套2瓶（需氧、厌氧各一瓶）；
2.合格的标本类型、送检次数、标本量；
3.明确规定需要尽快运送的标本；
4.合适的运送培养基；
5.延迟运送标本的保存方法及期限；
6.安全运送方法（如：密封容器、无标本外漏等）。
(二) 申请单信息
除一般要求外，应标明标本来源和种类，必要时说明感染类型和（或）目标微生物、抗菌药物使用信息。
(三)标本采集和运送
应遵循实验室制定的“标本采集手册”采集和运送标本。医务人员应记录标本采集时间，并尽可能记录患者自采标本的采集时间。
(四)标本接收
实验室接收的所有标本均应进行纸质或电子登记，记录接收时间，拒收以下标本：①容器不适合或泄漏，如培养标本未置无菌容器或标本渗漏；②标本错误或不恰当，如培养标本含福尔马林等固定液、Foley导尿管头培养、拭子干涸；③送检时间延迟或转送温度不适合。
五、检验过程
实验室应遵循行业标准或指南制定合格标本（或不合格标本）标准、各种标本处理的标准化操作程序、标本保留期限（用于核对或必要的补充试验），宜建立紧急检查程序，明确需要紧急处理的标本类型、检验项目，并遵照执行（相关技术资料可参阅“参考文献”）。
所选择的涂片、染色技术、培养基、培养环境应能识别、分离相应病原菌；鉴定方法应符合相关要求，如：通过革兰染色、菌落形态、生长条件、代谢反应、生化和酶活性、血清学、抗菌药物耐药谱等特性鉴定。
组织标本应碾磨后检验；痰培养应先染色镜检评估标本合格性，至少接种血平板和巧克力平板；尿液常规进行定量培养（菌落计数），能分离、鉴定革兰阳性和/或革兰阴性细菌；脑脊液培养标本立即处理，常规进行离心、革兰染色，至少接种血平板和巧克力平板，能分离常见苛养菌；阳性血培养瓶，根据直接涂片结果转种相应的培养基及培养环境。血平板和巧克力平板，均应置二氧化碳环境培养。
当流行病学或感染控制需要时，实验室应进行相应检测或将菌株送有条件的实验室进行检测。建议有条件的实验室建立相关检测技术，以满足流行病学或感染控制需要。
（二）抗菌药物敏感性试验
1、应遵循“全国细菌耐药监测网技术方案”、行业标准、制造商建议，尽量包括本医院临床常用抗菌药物，制定常规药敏试验方法的标准化操作程序，包括药敏试验操作步骤、各类病原体和/或标本的检测药物、质控方法和标准、结果报告和解释，特殊耐药性检测方法，少见药敏试验结果的处理步骤等。
2、抗菌药物敏感性试验方法包括纸片扩散法、稀释法（琼脂稀释法、肉汤稀释法）、浓度梯度扩散法（E试验）或自动化仪器检测。实验室应提供与服务相适应，且满足“全国细菌耐药监测网技术方案”的抗菌药物敏感性试验。
3、应在技术方案、行业标准、制造商文件更新6个月内完成抗菌药物敏感性试验方法标准化操作程序的修订并实施。
4、除常规药敏试验方法外，宜利用经评估的分子技术快速检测、鉴定临床分离菌株或标本（含血培养阳性培养基）中的病原体，以及细菌的耐药性。
六、检验后过程
(一)结果报告
尽快报告结果，为诊断、治疗、预防提供信息。宜开展分级报告，如无菌体液、组织标本涂片或湿片镜检结果、快速鉴定结果、药敏结果等。
出现对患者处理具有重要意义的结果时，应立即通知临床医生或相关人员。如血培养阳性结果、脑脊液显微镜检查及培养阳性结果、法定传染病。
应报告具有临床意义的结果。结果报告应与检验内容一致，如粪便沙门菌、志贺菌培养，报告为“未检出沙门菌、志贺菌”。
药敏报告应注意标本类型、细菌种类等，如粪便分离的伤寒沙门菌只报告氨苄西林、一种氟喹诺酮类药物和甲氧苄啶磺胺-甲噁唑。药敏报告单除一般信息外，应至少包括细菌、药物名称、折点、MIC值或抑菌圈直径、结果解释，不报告替代药物的药敏结果。
疑似医院感染暴发时，应立即报告医院感染控制相关人员。
(二) 菌种保存
实验室应遵照国家法令法规，如中华人民共和国国务院发布的《病原微生物实验室生物安全管理条例》等，制定菌种保存规定，严格管理菌种，保证有效、安全使用。
实验室应保存质控菌株，包括标准菌株、经证实的其它来源菌株。
菌种应有专人保管，详细记录名称、编号、来源、保存日期、传代等，不得擅自处理或带出实验室，如确需带离实验室，应做详细记录。
（三）检验后标本的处置
检验后标本、污染培养基等感染性废弃物最好在实验区域内消毒或去污染。如果在处理前运送，应置防穿刺、防渗漏容器，并适当标记和记录。
（四）耐药监测数据统计
至少每年进行一次本机构耐药监测数据统计并将结果发布给临床及相关人员，发现新的流行趋势时，应立即报告相关人员。
七、质量控制及质量改进
（一）标本
全国细菌耐药监测网网点医院应根据本院实际开展标本质量控制和改进工作。每年至少制定一种标本质量改进目标，并定期向相关部门（医务处、护理部和/或临床科室等）反馈、评估。
实验室应制定合格痰培养标本标准、不合格痰标本处理方法，并遵照执行。提倡实验室对有意义的培养标本实施直接显微镜检查及分级报告。
（二）抗菌药物敏感性试验
实验室引进抗菌药物敏感性试验新方法时，应以标准菌株连续检测20－30天，每一组药物/细菌超出参考范围（抑菌圈直径或MIC）的频率应不超过（≤）1/20或3/30；也可采用替代质控方案，即连续5天，每天对每一组药物/细菌重复测定3次，每次单独制备接种物，15个数据超出参考范围（抑菌圈直径或MIC）的结果应不超过（≤）1个，若失控结果为2-3个，则如前述，再进行5天，每天3次重复试验，30个数据失控结果应不超过（≤）3个。此后，应每周使用标准菌株进行质控。若检测频率低于每周1次，则每个检测日应进行质控。采用自动或半自动仪器检测MIC时，应按照制造商的要求进行质控。
（三）使用中试剂
实验室应制定使用中试剂质量控制周期和方法，满足以下要求：
1、使用中的染色剂，宜每周（如革兰染色，若检测频率低于每周1次，则实验当日）、当日（如抗酸染色）或每次（如抗酸杆菌荧光染色）用已知阳性和阴性（适用时）质控菌株检测。
2、凝固酶、过氧化氢酶、氧化酶、β-内酰胺酶，实验当日应做阴性和阳性质控，商业头孢菌素试剂的β-内酰胺酶试验应遵循制造商的建议。诊断性抗血清试剂，实验当日至少应做多价血清阴性和阳性质控。定性试验试剂每次检测时应至少包括阳性和阴性质控菌株。不含内质控的直接抗原检测试剂，实验当日应检测阳性和阴性质控。
(四)质控品
应贮存与诊断相配套的质控物，以便在染色、试剂（包括培养基）、试验、鉴定系统和抗菌药物敏感性试验中使用。最理想的质控菌是标准菌株，但实验室难以获得与其检测能力相应的所有标准菌株，可依次选择标准菌株、能力验证或室间质评菌株，以及其它来源的已知菌株用于质量控制。
药敏试验应选用标准菌株。药敏试验质控所用标准菌株和药物的种类和数量应覆盖向临床报告药敏结果的菌种和药物种类。实验室应保存标准菌株的来源、传代等记录，并有证据表明标准菌株性能满足要求，至少贮存以下标准菌株：大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923（纸片法）、金黄色葡萄球菌ATCC29213（MIC法）、肺炎链球菌ATCC49619、粪肠球菌ATCC29212（MIC法）、流感嗜血杆菌ATCC49247或ATCC49766（取决于所测试药物）。
（五）检验结果一致性
实验室应制定人员比对程序，规定由多名专业人员实施的手工检验项目的验证方法和判断标准，定期进行工作人员的能力比对，至少包括显微镜检查、培养结果判读、抑菌圈测量、结果报告。
(六) 检验结果准确性
应有证据表明临床检验及细菌耐药监测结果的准确性，内容至少包括细菌分离（包括苛养菌）、鉴定、药敏。通常以参加能力验证或室间质量评价活动且获得合格结果来证明。实验室应保留参加能力验证/室间质评活动的原始记录、结果和证书。
检验结果准确性评价应由从事常规工作的人员使用与患者标本相同的检验方法进行。禁止与其他实验室核对检测结果。对“不满意”和“不合格”的评价结果需进行分析，采取纠正措施并记录。
参考文献（下列文献可作为技术资料。请参考其最新版本）：
1.《全国细菌耐药监测网技术方案》（国家卫生计生委合理应用专家委员会）
2.《CNAS—CL02：医学实验室质量和能力认可准则》（中国合格评定国家认可委员会）
3.《病原微生物实验室生物安全管理条例》（中华人民共和国国务院令）
4.《临床实验室生物安全指南》（WS442）
5.《人间传染的病原微生物名录》（国家卫生健康委员会）
6.《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（国家卫生健康委员会）
7.《临床微生物学检验标本的采集和转运》（WS∕T 640 ）
8.《下呼吸道感染细菌培养操作指南》（WS/T499）
9.《尿路感染临床微生物实验室诊断》（WS/T 489）
10.《临床微生物实验室血培养操作规范》（WS/T 503）
11.《细菌性腹泻临床实验室诊断操作指南》（WS/T 498）
13.《全国临床检验操作规程》，人民卫生出版社
14.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing M100. Clinical and laboratory institute
15.《Clinical Microbiology Procedures Handbook》（ASM press）